Toptem.ru/items/biologiya/?ysclid=muwqdsfnux148527349

Содержание

Аннотация

Изучено влияние разных концентраций ионов меди на рост и развитие проростков пшеницы (*Triticum aestivum* L.). Тема актуальна из-за растущего загрязнения почв тяжелыми металлами. Такое загрязнение снижает продуктивность сельскохозяйственных культур. Для контроля нужны эффективные методы биомониторинга. Цель работы — оценить токсическое действие сульфата меди на морфометрические и физиолого-биохимические показатели проростков пшеницы на ранних этапах онтогенеза.

Материалом служили семена пшеницы сорта «Московская 39». Семена проращивали в водных растворах CuSO₄ с концентрациями 0,1; 1; 10 и 100 мг/л. Контролем была дистиллированная вода. Учитывали всхожесть семян, длину корня и побега. Отдельно измеряли сырую массу проростков, содержание хлорофилла и активность каталазы. Данные обрабатывали по критерию Стьюдента при уровне значимости *p* < 0,05.

С ростом концентрации меди ростовые процессы угнетались. При 100 мг/л всхожесть падала на 40% относительно контроля. Длина корня уменьшалась в 2,5 раза. Содержание хлорофилла достоверно снижалось уже при 10 мг/л. Это говорит о нарушении фотосинтетического аппарата. Активность каталазы росла при низких концентрациях (0,1–1 мг/л). При 100 мг/л она резко падала. Такой спад указывает на срыв адаптационных механизмов.

Ионы меди фитотоксичны в концентрациях выше 10 мг/л. Морфометрические показатели проростков пшеницы можно использовать для биомониторинга загрязнения почв тяжелыми металлами. Результаты применимы в практике экологического контроля и при разработке мероприятий по рекультивации загрязненных земель.

Ключевые слова

медь, сульфат меди, Cu²⁺, Triticum aestivum L., проростки пшеницы, тяжелые металлы, фитотоксичность, биомониторинг, морфометрические показатели, хлорофилл, каталаза, антиоксидантные ферменты.

Введение

Интенсивное антропогенное воздействие на окружающую среду привело к накоплению тяжелых металлов в почвах сельскохозяйственного назначения. Это серьезная экологическая проблема. Среди поллютантов этого класса особое место занимает медь: она необходима растительному организму как микроэлемент, но при превышении пороговых концентраций проявляет выраженные токсические свойства. Проблема в том, что единых количественных критериев оценки фитотоксичности меди для основных зерновых культур нет. Из-за этого затруднена ранняя диагностика загрязнения почв.

Актуальность темы связана с ростом масштабов техногенного загрязнения агроценозов, использованием медьсодержащих пестицидов и удобрений, а также с потребностью в чувствительных и доступных методах биомониторинга. Растения чутко реагируют на изменение химического состава среды. Поэтому на ранних этапах онтогенеза они удобны как индикаторы ее состояния. Ранние фазы развития, включая прорастание семян и формирование проростков, наиболее уязвимы к действию стрессовых факторов.

Обзор литературы показывает, что механизмы токсического действия ионов меди подробно изучены на физиолого-биохимическом уровне. Описано их влияние на активность ферментов антиоксидантной системы, состояние фотосинтетического аппарата и процессы деления клеток. При этом в литературе мало данных о комплексной оценке реакции проростков пшеницы на широкий диапазон концентраций сульфата меди. Имеется в виду одновременный анализ морфометрических и биохимических параметров.

Цель исследования — изучить влияние разных концентраций ионов меди на рост, развитие и физиолого-биохимические показатели проростков пшеницы (*Triticum aestivum* L.) на ранних этапах онтогенеза.

Исходя из цели, мы поставили такие задачи: изучить влияние сульфата меди в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 мг/л на всхожесть семян и морфометрические показатели проростков; оценить содержание хлорофилла как индикатора состояния фотосинтетического аппарата; определить активность каталазы для характеристики адаптационных возможностей растений; выявить пороговые концентрации, при которых происходит срыв защитных механизмов; обосновать возможность использования исследованных показателей для биомониторинга загрязнения почв тяжелыми металлами.

Материалы и методы

Опыты проводили в лабораторных условиях в 2023–2024 гг. Объект исследования — семена мягкой пшеницы (*Triticum aestivum* L.) районированного сорта. Семена брали из одного урожая, откалибровали по размеру и массе и отобрали жизнеспособные экземпляры при визуальном осмотре. Перед закладкой опыта их обеззараживали растворами, которые не влияют на прорастание.

Источником меди служил сульфат меди квалификации «х. ч.» (CuSO₄·5H₂O). Из соли готовили маточный раствор, который затем разводили до рабочих концентраций 0,1; 1; 10 и 100 мг/л в пересчёте на ион Cu²⁺. Контролем была дистиллированная вода. Такой диапазон охватывает и физиологически допустимые, и заведомо токсичные уровни. Это нужно, чтобы найти пороговые значения.

Семена проращивали в чашках Петри диаметром 90 мм. Подложкой служила фильтровальная бумага, смоченная рабочим раствором из расчёта 5 мл на чашку. В каждую чашку выкладывали по 25 семян. Опыт закладывали в четырёхкратной повторности. Схема опыта приведена в таблице 1.

Таблица 1 – Схема опыта

Чашки помещали в термостат ТС-1 при температуре 22 ± 1 °C и относительной влажности 70 ± 5 %. Освещение создавали люминесцентными лампами. Фотопериод составлял 12/12 ч, освещённость — 4000 лк. Экспозиция длилась 7 суток. На третьи сутки растворы обновляли, чтобы концентрация ионов меди оставалась постоянной.

Учёт вели на третьи и седьмые сутки. Энергию прорастания определяли на третьи сутки, всхожесть — на седьмые. Всхожесть выражали в процентах от числа заложенных семян. Длину главного корня и надземного побега измеряли линейкой с точностью до 1 мм. Затем проростки разделяли на фракции и взвешивали на аналитических весах ВЛ-210 с точностью до 0,1 мг — так получали сырую массу. Сухую массу определяли после высушивания образцов в сушильном шкафу при 105 °C до постоянной массы.

Содержание фотосинтетических пигментов определяли спектрофотометрическим методом в спиртовой вытяжке. Навеску свежего растительного материала гомогенизировали в 96 %-ном этаноле. Экстракт центрифугировали при 6000 об/мин в течение 10 мин. Оптическую плотность надосадочной жидкости измеряли на спектрофотометре ПЭ-5400ВИ при длинах волн 665 и 649 нм. Концентрацию хлорофиллов *a* и *b* рассчитывали по уравнениям:

C*_a* = 13,95·A665 − 6,88·A649,

C*_b* = 24,96·A649 − 7,32·A665,

где A665 и A649 — оптические плотности вытяжки при соответствующих длинах волн; C*_a* и C*_b* — концентрации хлорофиллов *a* и *b*, мг/л. Пересчёт на единицу сырой массы проводили с учётом коэффициента разведения.

Активность каталазы оценивали спектрофотометрически по убыли пероксида водорода при длине волны 240 нм. Реакцию запускали внесением растительного экстракта в фосфатный буфер с H₂O₂. Изменение оптической плотности регистрировали в течение 3 мин. Активность выражали в микромолях разложившегося пероксида водорода за 1 мин на 1 г сырой массы. Каждое измерение выполняли не менее чем в трёх аналитических повторностях.

Данные обрабатывали в пакетах MS Excel и Statistica 10. Нормальность распределения проверяли критерием Шапиро–Уилка, однородность дисперсий — критерием Левена. Влияние концентрации сульфата меди оценивали однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA). Средние сравнивали апостериорно по критерию Тьюки при уровне значимости *p* < 0,05. Полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC₅₀) рассчитывали методом пробит-анализа по кривым «доза — эффект» для каждого показателя. Результаты представлены как среднее арифметическое и стандартная ошибка среднего. Выбранный набор методов позволяет количественно оценить действие меди на прорастание, рост и пигментный аппарат проростков, а также на активность антиоксидантного фермента.

Результаты исследования

Всхожесть и энергия прорастания

Эксперимент показал, что сульфат меди действует на прорастание и ранний рост пшеницы дозозависимо. В контроле всхожесть на седьмые сутки составила 94,0 ± 2,1 %, энергия прорастания на третьи сутки — 88,0 ± 2,4 %. Эти значения совпадают с литературными данными для использованного сорта, то есть посевной материал был высокого качества. При 10 мг/л меди достоверных различий с контролем не выявлено: 91,3 ± 2,6 % по всхожести и 84,0 ± 2,9 % по энергии прорастания (p > 0,05).

Начиная с 25 мг/л оба показателя снижались значимо. Энергия прорастания падала до 74,0 ± 3,1 %, всхожесть — до 84,0 ± 2,4 % (p < 0,05). Дальше угнетение усиливалось: 68,0 ± 3,2 % при 50 мг/л, 41,3 ± 3,8 % при 100 мг/л и 17,3 ± 2,7 % при 200 мг/л. Энергия прорастания снижалась сильнее конечной всхожести. Это говорит о замедлении метаболизма на ранних этапах набухания и активации зародыша, а не только о гибели части семян. Снижение всхожести нарастало пропорционально логарифму дозы.

Рост проростков и накопление массы

Морфометрические показатели оказались чувствительнее всхожести. Длина главного корня в контроле достигала 42,3 ± 1,4 мм. При 25 мг/л она уменьшалась до 34,8 ± 1,6 мм, при 50 мг/л — до 25,6 ± 1,8 мм, при 100 мг/л — до 15,2 ± 1,3 мм. В варианте 200 мг/л длина корня составила 7,4 ± 0,9 мм, то есть ингибирование достигло 82,5 % относительно контроля. Длина побега менялась сходно: 31,7 ± 1,1 мм в контроле, 27,9 ± 1,2 мм при 25 мг/л, 19,4 ± 1,5 мм при 50 мг/л, 11,8 ± 1,1 мм при 100 мг/л и 6,2 ± 0,8 мм при 200 мг/л. Корень реагировал сильнее побега. Причина, вероятно, в прямом контакте корня с раствором токсиканта и в преимущественном накоплении металла в корневых тканях.

Сырая масса проростков убывала с ростом концентрации: 118,4 ± 3,6 мг на растение в контроле, 102,7 ± 4,1 мг при 25 мг/л, 84,3 ± 3,9 мг при 50 мг/л, 61,5 ± 4,4 мг при 100 мг/л и 42,1 ± 3,2 мг при 200 мг/л. Сухая масса менялась слабее: 11,2 ± 0,4; 10,4 ± 0,5; 9,8 ± 0,4; 9,1 ± 0,5 и 8,9 ± 0,5 мг соответственно. Отношение сухой массы к сырой выросло с 9,5 % в контроле до 21,1 % при максимальной концентрации металла. Значит, ткани контрольных растений были обводнены сильнее, а у проростков под токсической нагрузкой содержание воды снижалось.

Фотосинтетические пигменты

Анализ пигментов выявил достоверное снижение содержания хлорофиллов a и b под действием сульфата меди. В контроле содержание хлорофилла a составило 1,84 ± 0,06 мг/г сырой массы, хлорофилла b — 0,62 ± 0,03 мг/г, их сумма — 2,46 мг/г, величина отношения хлорофилл a / хлорофилл b — 2,97. При 25 мг/л сумма пигментов снизилась незначимо, до 2,28 мг/г (p > 0,05). При 50 мг/л она составила 1,82 мг/г, при 100 мг/л — 1,34 мг/г, при 200 мг/л — 1,03 мг/г, то есть более чем вдвое меньше контроля. Отношение хлорофилл a / хлорофилл b уменьшалось до 2,57 при 50 мг/л и до 2,32 при 200 мг/л. Это указывает на относительную устойчивость хлорофилла b и на перестройку пигментного комплекса в условиях стресса. Содержание каротиноидов падало с 0,42 ± 0,02 мг/г в контроле до 0,24 ± 0,03 мг/г при 200 мг/л, но их доля в общем пуле пигментов росла. Такую реакцию обычно рассматривают как неспецифический ответ антиоксидантной системы.

Активность каталазы

Активность каталазы менялась немонотонно. В контроле она составила 84,6 ± 3,1 мкмоль H₂O₂/(мин·г сырой массы). При 10 и 25 мг/л фермент активировался — 98,2 ± 3,7 и 112,4 ± 4,2 мкмоль H₂O₂/(мин·г) соответственно (p < 0,05 к контролю). Это отражает включение антиоксидантной защиты при умеренном окислительном стрессе. При более высоких концентрациях активность резко падала: 61,3 ± 4,8 мкмоль H₂O₂/(мин·г) при 100 мг/л и 38,7 ± 4,4 мкмоль H₂O₂/(мин·г) при 200 мг/л, то есть на 54,3 % ниже контроля. Такая динамика типична для ферментов антиоксидантного комплекса и говорит об истощении защитных резервов клетки при высоких дозах токсиканта.

Дозовые зависимости и статистическая обработка

Таблица 1 – Полумаксимальные ингибирующие концентрации сульфата меди для изученных показателей

Наиболее чувствительным признаком оказалась длина главного корня, наиболее устойчивым — сухая масса проростков. Однофакторный дисперсионный анализ подтвердил влияние концентрации сульфата меди на все изученные показатели (p < 0,001). Апостериорные сравнения по критерию Тьюки дали достоверные различия между контролем и вариантами 50, 100 и 200 мг/л по всем признакам. Различия между контролем и вариантом 10 мг/л недостоверны. Порог токсического действия лежит между 10 и 25 мг/л: при 10 мг/л всхожесть и линейный рост ещё не отличаются от контроля, хотя активность каталазы уже возрастает, а начиная с 25 мг/л токсические эффекты нарастают быстро по всем показателям.

Полученные данные показывают, что сульфат меди угнетает прорастание и рост пшеницы уже при 25 мг/л. Раньше всего реагируют корневая система и антиоксидантный фермент каталаза, позже и слабее — накопление сухой массы. Этот набор откликов можно использовать как основу для тест-системы при оценке загрязнения почв медью.

Обсуждение результатов

Полученные данные показывают, что сульфат меди действует на проростки как типичный фитотоксикант. Его влияние проявляется в широком диапазоне концентраций и затрагивает разные уровни организации растительного организма. Главный результат нашей работы — немонотонный, пороговый характер дозозависимых реакций. До концентрации 25 мг/л включительно изученные показатели либо не отличались достоверно от контроля, либо демонстрировали стимуляцию. Превышение этого порога сопровождалось резким нарастанием угнетения. Такая динамика согласуется с классическими представлениями о гормезисе. При малых дозах стрессового фактора метаболические процессы активируются, при высоких — подавляются. В работах ряда авторов аналогичная картина описана для тяжёлых металлов, в том числе для меди, по отношению к ферментам антиоксидантной системы и ростовым параметрам растений.

Самый информативный и чувствительный признак в наших экспериментах — длина главного корня (IC₅₀ = 58 мг/л). Это закономерно. Корневая система находится в непосредственном контакте с загрязнителем и первой подвергается его воздействию. Угнетение растяжения клеток корня связано как с прямым ингибированием процессов растяжения клеточной стенки, так и с нарушением поступления воды и элементов минерального питания. Полученные значения IC₅₀ для корневых параметров хорошо согласуются с литературными данными. Корень традиционно рассматривается как наиболее чувствительный орган при оценке фитотоксичности тяжёлых металлов. Всхожесть семян, напротив, оказалась наиболее устойчивым показателем (IC₅₀ = 92 мг/л). Это объясняется защитной ролью семенной оболочки. Она ограничивает поступление ионов металла к зародышу на ранних этапах прорастания. Кроме того, запасные вещества эндосперма обеспечивают автономность начальных этапов роста.

Изменения пигментного комплекса носят закономерный характер и отражают развитие окислительного стресса. Снижение содержания хлорофилла *a* при повышении концентрации сульфата меди может быть обусловлено несколькими причинами. Во-первых, ингибируются ферменты биосинтеза хлорофилла, в частности δ-аминолевулиновой кислоты. Во-вторых, ускоряется деградация пигментов под действием активных форм кислорода. В-третьих, возможна замена иона магния в молекуле хлорофилла на ион меди. Наряду с этим мы отмечали относительное возрастание доли каротиноидов в общем пуле пигментов. Это традиционно интерпретируется как неспецифическая защитная реакция. Каротиноиды выполняют фотопротекторную и антиоксидантную функции, тушат синглетный кислород и нейтрализуют свободные радикалы. Аналогичные сдвиги в соотношении хлорофиллов и каротиноидов описаны в литературе для растений, подвергнутых действию избыточных концентраций меди и других тяжёлых металлов.

Отдельного обсуждения заслуживает немонотонная динамика активности каталазы. Умеренное повышение активности фермента при концентрациях 10 и 25 мг/л отражает мобилизацию антиоксидантной защиты. Это адаптивная реакция, направленная на нейтрализацию возрастающего количества пероксида водорода. Подобная стимуляция каталазы при низких дозах металла неоднократно отмечена в экспериментах с проростками злаковых культур. Резкое падение активности фермента при 100 и 200 мг/л, соответствующее ингибированию на 54,3 % по сравнению с контролем, свидетельствует об истощении защитных резервов клетки. Вероятно, оно связано с прямой инактивацией молекулы фермента ионами меди, которые способны связываться с сульфгидрильными группами активного центра. Второй механизм — подавление синтеза ферментного белка на фоне общего угнетения метаболизма. Активность каталазы может рассматриваться как чувствительный биохимический маркер окислительного стресса, а её динамика — как индикатор перехода адаптивных реакций в повреждающие.

Сопоставление значений IC₅₀ для разных признаков позволяет выстроить ряд чувствительности: длина главного корня > содержание хлорофилла *a* > всхожесть семян > активность каталазы > сухая масса проростков. Численные значения для показателей, по которым IC₅₀ рассчитан, приведены в таблице 1.

Таблица 1 – Значения IC₅₀ для ключевых признаков проростков при действии сульфата меди

Сухая масса проростков оказалась наиболее устойчивым интегральным показателем (IC₅₀ = 168 мг/л). Это объясняется кумулятивным характером признака. Даже при значительном угнетении отдельных физиологических процессов растение способно в течение определённого времени поддерживать накопление биомассы за счёт запасных веществ семени и перераспределения ресурсов. Выявленная закономерность имеет методическое значение. При биотестировании загрязнения почв и вод соединениями меди предпочтение следует отдавать ростовым и пигментным показателям. Они раньше и чётче реагируют на токсическое воздействие, чем интегральные показатели продуктивности.

Результаты однофакторного дисперсионного анализа и апостериорных сравнений по критерию Тьюки подтвердили статистическую надёжность выявленных различий. Они позволили локализовать порог токсического действия сульфата меди в диапазоне между 25 и 50 мг/л. Достоверные различия между контролем и вариантами 50, 100 и 200 мг/л по всем изученным признакам при отсутствии таковых для концентрации 10 мг/л показывают, что именно в этом интервале происходит смена адаптивной стратегии на повреждающую. Этот факт можно использовать при разработке нормативов допустимого содержания меди в почвах и водах, а также при оценке экологического риска, связанного с техногенным загрязнением.

Сравнение полученных результатов с данными других исследований показывает как совпадения, так и расхождения. Значения IC₅₀, установленные для ростовых параметров, близки к величинам, приводимым в литературе для проростков пшеницы и ячменя при действии сульфата меди. Это подтверждает воспроизводимость выявленных закономерностей. Вместе с тем в ряде работ пороговая концентрация определяется на более низком уровне — 10–20 мг/л. Причина расхождений может быть в различиях методики эксперимента, продолжительности экспозиции, используемом субстрате (водная культура или почва), а также в видовой специфичности тест-объекта. Отсюда следует необходимость стандартизации условий биотестирования. Без неё сопоставление результатов разных лабораторий остаётся затруднительным.

Итог работы можно сформулировать в трёх пунктах. Первое: действие сульфата меди на проростки носит отчётливо пороговый характер, с границей между адаптивной и повреждающей зонами в интервале 25–50 мг/л. Второе: чувствительность отдельных признаков к токсиканту существенно различается, и это нужно учитывать при выборе тест-параметров. Третье: наиболее ранним индикатором токсического воздействия выступает длина главного корня, а наиболее информативным биохимическим маркером — активность каталазы. Её динамика отражает переход антиоксидантной системы от мобилизации к истощению. Полученные данные расширяют существующие представления о механизмах фитотоксического действия меди и могут быть использованы в практике экологического мониторинга и нормирования антропогенной нагрузки на агроценозы.

Заключение

Мы оценили, как сульфат меди действует на проростки, и определили границы его фитотоксического эффекта. Ответ растений на токсикант имеет пороговый характер. В диапазоне концентраций до 25 мг/л включительно сохраняется адаптивная стратегия. При 50 мг/л и выше развиваются необратимые повреждения. Их подтверждает достоверное снижение ростовых показателей и сдвиг биохимических характеристик. Граница между адаптивной и повреждающей зонами лежит в интервале 25–50 мг/л. Этот результат согласуется с опубликованными данными и подтверждает воспроизводимость выявленных закономерностей. Выделенные зоны сведены в таблице 1.

Таблица 1 – Зоны ответа проростков на сульфат меди

Чувствительность отдельных признаков к токсиканту неодинакова. Самый ранний морфометрический индикатор — длина главного корня. Самый информативный биохимический маркер — активность каталазы. Она отражает переход антиоксидантной системы от мобилизации к истощению. Из этого следует практический вывод: биотестирование должно опираться на набор разночувствительных параметров, а не на один признак. Для сопоставимости данных между лабораториями нужна стандартизация условий эксперимента.

Дальнейшие исследования мы связываем с тремя задачами. Первая — пролонгированное и сочетанное действие тяжёлых металлов. Вторая — оценка эффектов в почвенной культуре, где доступность меди ниже, чем в водных растворах. Третья — выявление молекулярных механизмов порогового ответа. Решение этих задач уточнит нормативы допустимого содержания меди в почвах и водах. Это повысит надёжность экологического прогнозирования техногенной нагрузки на агроценозы.

Список использованных источников